熒光顯微鏡里看的啥？

我們在明場光下做生物組織的形態(tài)觀察、組織化學(xué)成分研究用的是白光光源穿透薄片樣品來收集圖像，這是最基礎(chǔ)的光學(xué)成像模式，也是教科書上Robert Hooke第一次觀察到植物細胞繼而以cell命名細胞時所用的觀察方式。

如果明場成像是白天模式，那么熒光成像則是黑夜模式，而且它還能做更多的亞細胞研究，黑夜模式下我們要尋找的熒光就是黑夜里的星星和月亮。在熒光顯微鏡里看的是熒光樣品被特定激發(fā)光照射之后受激發(fā)射而來的可見光，這些可見的熒光反射回到光路里最終被我們觀測到。今天我們就來聊一聊如何準確地在黑夜里找到我們想找的星星和月亮。先擺個熒光顯微鏡的光路圖給大家瞄一眼，高手請自動過濾，新手請研習。最怕新手在實驗室里看著熒光圖像時狂調(diào)明場光聚光鏡并告訴我調(diào)聚光鏡如何有效云云...三兩下過后姐就得重新做個科勒照明，不然后面要拍明場圖像的同學(xué)就悲催了。

言歸正傳，想知道如何準確找出樣品里的熒光，我們還得從光譜的角度認識這些能被檢測到的熒光的性質(zhì)。

正如上圖所示，電磁波譜覆蓋范圍根據(jù)波長從短到長依次從宇宙射線、X光、紫外光、可見光、紅外光、雷達、無線電波、廣播波段，而我們在顯微成像中說的光譜是指圖中放大部分從近紫外到近紅外波段，在電磁波譜里面波長越短能量就越強，所以當我們用連續(xù)光（脈沖激發(fā)光那些以后再聊）激發(fā)樣品時都是用短波長的激發(fā)光去激發(fā)樣品發(fā)射出長波長的可見光。正如圖中放大區(qū)域所示，我們在熒光顯微鏡里面能觀測到的可見光波段包含了藍紫、藍、青、綠、黃、橙、紅、深紅等顏色的光，它們的能量依次遞減。

我們在熒光顯微鏡中觀測到的熒光是如何產(chǎn)生的呢？

當熒光樣品受到激發(fā)光照射接收足夠能量便能從穩(wěn)定的基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)非常不穩(wěn)定勢必要回歸基態(tài)，熒光樣品通過發(fā)出熒光的方式釋放能量回歸基態(tài)。用于熒光顯微觀察的熒光樣品必須具備這種特點，然而許多樣品里能受激發(fā)熒光的物質(zhì)不是永恒存在，所以會出現(xiàn)熒光觀察過程中越來越暗的情況，這種現(xiàn)象我們稱之為“熒光淬滅”（制樣的過程選擇含有抗淬滅劑的封片劑可減緩熒光淬滅）。

在熒光顯微鏡的硬件里依靠濾光片組合為我們做光的篩選。以下圖以GFP綠色濾光片組為例進行詳細說明：左側(cè)光源是由金屬鹵化物燈或汞燈帶給我們近紫外到近紅色的激發(fā)光，通過藍色濾光片僅讓藍色光通過到達斜著放的二向色鏡反射到達樣品，樣品接收藍色光激發(fā)發(fā)射出比藍色光波長更長的綠色熒光等，反射出來的熒光僅有綠色熒光能穿透二向色鏡最終穿透中最上方的綠色濾光片再次過濾到達目鏡，至此我們才能在目鏡里看到相對準確的綠色熒光信號。

使用某臺熒光顯微鏡前，最好確認機身所含的熒光濾光片組合是否能匹配樣品所帶的熒光，例如一臺標配三色熒光的顯微鏡（藍DAPI、綠GFP、紅Rohd）就沒法給我們完美地呈現(xiàn)青色熒光或黃色熒光的圖像。濾光片組是一臺熒光顯微鏡檢測范圍的一個很重要的因素，選擇合適的濾光片組才能讓我們準確找到所要觀察的星星和月亮，所以千萬不能忽略了它們喲！

聊了一些硬件的原理，咱們放松一下欣賞幾張熒光圖片。

上圖是在熒光體式顯微鏡所拍的帶GFP標記的斑馬魚幼苗（這是一條活魚，至于為啥能讓它乖乖呆著不動，是因為我們把它放在了瓊脂糖凝膠里。在0.1M的瓊脂糖凝膠里斑馬魚寶貝們依然能夠正常呼吸活好幾天，我們除了對它的組織結(jié)構(gòu)進行觀察之外若經(jīng)過特殊處理后我們還能利用更多高端顯微鏡輕松觀察到例如血液流動，表皮色素形成，神經(jīng)生長之類的動態(tài)變化過程。

上圖是熒光顯微鏡所拍的擬南芥原生質(zhì)體的明場成像與熒光成像，兩種成像模式結(jié)合起來能給我們提供更多信息，比如上圖中我們能在明場模式下確定原生質(zhì)體是否完整。這里的熒光圖片也是同學(xué)們常和我提起的問題--用紅色熒光濾光片組合無法區(qū)分mcherry與葉綠體的紅色自發(fā)熒光（以后另寫推文分享解決這個問題的若干方法）。

上圖是做了細胞核（藍色）和兩種微管蛋白（綠色、紅色）和三色熒光疊加的圖片。這里要和大家分享一下，如果染了微管或者微絲的熒光，記得用高倍物鏡來成像哦，低倍鏡的數(shù)值孔徑較低，分辨能力差，很可能看到一團糊的熒光，一般我都推薦至少用40倍或更高倍數(shù)的物鏡來觀察。

PS：小伙伴們設(shè)計實驗特別是制樣前購買熒光染料或構(gòu)建熒光載體時需要充分考慮熒光的波長，選擇和自己實驗室熒光顯微鏡濾光片組匹配的染料，多色熒光成像還需考慮熒光和熒光之間在光譜上面不要太過接近，避免熒光串色，傻傻分不清，最后實驗白做！

還有更多關(guān)于熒光顯微鏡的問題，歡迎聯(lián)系集思，我們將為您提供優(yōu)質(zhì)的服務(wù)。

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